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2022

用5-修饰的dU家族修饰序列

来源：

长沙瀚辰生物科技有限公司

　　　　用5-修饰的dU家族修饰序列

氨基修饰剂C6 dT(10-1039)及一系列可用于各种用途的类似物是真正的dU类似物，但它们在引物和探针中表现为dT。通过使用dU碱基[1]的5位，连接的标签可以接入双链DNA的主凹槽中的并易于检测。即使是非常大的分子，如辣根过氧化物酶，也可以附着在该位置，而对正常杂交干扰小。在本文中，我们将介绍设计用于修饰、荧光标记，淬灭剂和点击化学的家族集。

　　一、修饰

　　氨基修饰剂C6 dT(Amino-Modifier C6 dT)具有长间隔子，旨在将标签扩远超出杂交限度，而密切相关的氨基修饰剂C2 dT(Amino-Modifier C2 dT)允许标签与相邻的DNA链相互作用。在这两种情况下，伯氨基在脱保护时被释放出来，准备在合成后偶联到合适的标签上，例如，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯。在这两种情况下，氨基被三氟乙酸盐(TFA)保护。目前仍未发现允许TFA基团从氨基修饰剂中除去而寡核苷酸仍然附着在载体上的条件，但是可以通过使用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)保护基团来解决这个问题。可以在合成柱上除去Fmoc基团并与各种活性酯进行柱上反应，Fmoc 氨基修饰剂C6 dT(Fmoc Amino-Modifier C6 dT)是用于此目的的dT类似物。羧基-dT(Carboxy dT)在室温下用0.4M甲醇氢氧化钠(甲醇:水=4:1)脱保护17小时会水解，并且可以通过标准肽偶联或通过中间体NHS酯直接偶联到含有伯氨基的分子上。随着NHS-羧基-dT(NHS-Carboxy dT)的引入，可以在带有氨基标记的寡核苷酸上一个或多个位点标记而仍然连在载体上。这开辟了在亚磷酰胺不可用时标记寡核苷酸内任意数量的不同染料或分子的可能性。这样做很简单，可以在合成器外手动完成，或者在DNA合成器上以完全自动化的方式完成。相比氨基，更多研发者需要硫醇修饰的，因此开发了S-Bz-硫醇修饰剂C6-dT(S-Bz-Thiol-Modifier C6-dT)用于寡核苷酸合成。硫醇修饰剂C6-dT可以像往常一样添加到序列中所需位置。

　　二、标记

　　当然，使用氨基修饰剂C6 dT修饰寡核苷酸表现能力使得要求开发者预装最常用的标签。生物素和荧光素是两种最常用的标签，因此开发了生物素-dT(Biotin-dT)和荧光素-dT(Fluorescein-dT)。最早版本的FRET探针使用四甲基罗丹明(TAMRA)作为5'-荧光团的内部淬灭剂，该探针使用在dT位点内部修饰的寡核苷，且该修饰为氨基修饰的C6-dT，再用TAMRA-NHS酯标记合成，这样做相当不方便。TAMRA-dT的引入允许直接合成这种FRET探针。分子信标探针和其他夹型探针已经开始依赖于dabcyl分子的荧光淬灭特性。标准分子信标具有茎环结构，在5'-末端具有荧光素等荧光团，在3'-末端具有淬灭剂(通常是dabcyl基团)。然而，在其他夹型探针中，荧光团仍然位于5'-末端，但dabcyl基团位于序列内。寡核苷酸的结构应允许它形成夹子形，使荧光团在空间上与环茎中的淬灭剂相邻。另外，寡核苷酸可用作PCR引物，由于夹子形在双链扩增产物中不再存在，所以扩增产物的荧光强度与加入引物的量有关。Dabcyl-dT可用于直接掺入淬灭剂位点。

　　SIMA(HEX)是一种更稳定的HEX类似物，与HEX不同，它可以用AMA脱保护，而SIMA(HEX)-dT可用于序列标记。EDTA-C2-dT包含EDTA的三乙酯，允许对单链和双链DNA和RNA进行序列特异性切割。裂解反应仅在加入Fe(II)和二硫代尿酸甘油酯后才开始，因此易于控制。EDTA-C2-dT的裂解和脱保护应在室温下甲醇水溶液(甲醇/水=4:1溶液中含0.4M NaOH)中反应过夜。凭借出色的稳定性特征，二茂铁一直吸引着人们对DNA标记的极大兴趣，以产生用于电化学检测的探针。Ferrocene-dT很容易添加到寡核苷酸中，而不会破坏常规的杂交行为。

　　三、淬灭剂

　　TAMRA和Dabcyl都曾通过FRET或静态淬灭用作荧光淬灭剂。然而，久而久之，其他非荧光淬灭剂已经非常流行。其中包括Biosearch Technologies引入的黑洞淬灭器(BHQ)和Berry & Associates推出的Blackberry淬灭剂(BBQ)。Glen Research提供两种dT衍生物的BHQ染料，BHQ-1-dT和BHQ-2-dT。这两种BHQ染料适用于在450 - 650nm范围内淬灭荧光。BBQ-650-dT的最大吸收波长约为 650nm，能够在550 - 750nm范围内淬灭荧光。图4显示了几种产品的荧光发射和淬灭波长。

　　四、点击化学

　　铜(I)催化叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)反应形成1,2,3-三氮唑，在非常温和的条件下具有极好的特异选择性和效率。虽然已知铜离子会破坏DNA，通常产生链断裂，但在反应中使用铜稳定配体使得CuAAC反应可用于以极高的效率功能化炔烃修饰的DNA核碱基。该策略允许使用多种系列的叠氮化物标签用于寡核苷酸标记。

　　为了实现炔烃修饰寡核苷酸的高效点击化学标记，我们的dT类似物使用5-(八-1,7-二炔基)侧链。含有单个核苷酸炔基的寡核苷酸可以使用C8- Alkyne-dT制备。使用C8- Alkyne-dT，C8-TIPS-Alkyne-dT和C8-TMS-Alkyne的组合，可以在最多三个单独的点击反应中用不同的叠氮化物标签标记寡核苷酸。

　　5-Ethynyl-dU提供了与叠氮化物方便的点击偶联，以生成刚性附着在其中一个寡核苷酸碱基上的标签。当使用5-Ethynyl-dU以防止水合副反应时，需要温和的脱保护条件，从而降低随后点击反应的炔烃用量。TIPS-5-Ethynyl-dU含有受三异丙基硅基(TIPS)保护的炔基，其可防止在寡核苷酸合成和脱保护过程中酸或碱催化水合。合成后使用TBAF快速处理可去除TIPS保护基。

　　二苯并环辛基(DBCO)基团表现出以下用于寡核苷酸合成的理想性质：使用简单;在合成器上的溶液中稳定;对氢氧化铵和原子能稳定;在室温下，在17小时或更短的时间内具有出色的点击性能。DBCO-dT可用于在寡核苷酸内的任何位置插入DBCO基团，然后可用于与叠氮化物无铜点击偶联。

　　长沙瀚辰生物科技有限公司在生物染料合成及分离方面具有丰富经验，可为客户提供全面的荧光染料、淬灭基团、化学发光试剂等。依托强大的分析、分离、合成平台，善于开发各类稳定性差的产品及独特产品的定制。同时基于我司完善的质量管理体系，保证产品质量稳定可靠、批间差异小，产品质量完全对标进口产品。目前我司已为多家IVD企业开发了复杂结构的荧光染料试剂。

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　　联系方式：罗先生 18175992585(微信同号)

　　长沙瀚辰生物可提供上述产品，产品仅用于科研。

关键词：

淬灭剂,BHQ